线粒体DNA（mtDNA）突变的积累是线粒体功能障碍的主要驱动因素，而线粒体功能障碍与衰老及多种病理过程密切相关。POLG是DNA聚合酶γ的催化亚基，对mtDNA复制至关重要；值得注意的是，其校对功能的缺陷会加速mtDNA突变的积累。
2026年8月26日，中国科学院广州生物医学与健康研究院王可品，赖良学和梁艳慧共同通讯在Science Advances 在线发表题为“Development of mitochondrial mutator pigs exhibiting increased mitochondrial DNA mutations and premature aging via prime editing”的研究论文。该研究将prime editing技术与体细胞核移植技术相结合，成功构建了表达校对缺陷型POLG的线粒体突变猪模型。
这些猪表现出体细胞mtDNA突变负荷升高，并重现了关键的早衰表型，包括体重下降、毛发粗糙、贫血、皮肤及睾丸间质结构改变、凋亡增加、衰老相关标志物上调，最终导致寿命缩短。鉴于猪与人类在生理和代谢上的相似性，该线粒体突变猪模型为解析mtDNA突变在衰老及年龄相关疾病中的机制性作用，以及加速治疗策略的临床转化，提供了一个理想的临床前研究工具。
线粒体基因组位于线粒体内部，以母系遗传方式传递，在维持线粒体和细胞稳态中发挥关键作用。大量证据表明，非特异性线粒体DNA（mtDNA）突变的过度负担是驱动衰老及年龄相关疾病的重要因素。为阐明线粒体功能障碍与衰老及年龄相关疾病之间的分子联系，并探索潜在的治疗干预策略，研究者已建立了多种因mtDNA突变而加速线粒体功能障碍的动物模型。其中，通过向核DNA聚合酶γ（Polg）基因引入突变而构建的线粒体突变小鼠模型，已成为解析mtDNA突变、线粒体功能障碍与衰老进程之间复杂关系的强大工具。Polg基因编码mtDNA聚合酶γ的催化亚基，该酶包含一个DNA聚合酶结构域和一个3′至5′核酸外切酶结构域。核酸外切酶结构域对于校对过程至关重要，可确保新合成mtDNA的保真度。将3′至5′核酸外切酶结构域第257位的关键天冬氨酸（D）残基替换为丙氨酸（A）（D257A），会损害其校对活性。该缺陷导致mtDNA复制过程中错误率显著增加，从而加速小鼠体细胞mtDNA突变的积累。在表型上，线粒体突变小鼠表现出寿命缩短和一系列早衰特征，包括体重下降、皮下脂肪减少、脱毛、脊柱后凸和细胞凋亡增加。
尽管携带高负荷线粒体突变的小鼠模型为揭示mtDNA突变驱动衰老的基本机制提供了宝贵见解，但其仍存在固有局限性，如寿命短、体型小，以及代谢需求和线粒体生物发生方面的差异，这些限制了临床前发现向人类的直接转化。此外，这些模型通常表现出比携带致病性mtDNA突变的患者更轻微的表型。因此，迫切需要一个在生理学上更具相关性的、能够特异性重现线粒体突变特征的大动物模型。
图1.通过SCNT建立PE3介导的pPOLGD260A克隆猪模型（摘自Science Advances ）
猪因其在解剖学和生理学上与人类的深度相似性，已成为模拟人类线粒体疾病和自然衰老的理想候选模型。因此，构建一个表达校对缺陷型POLG变体的线粒体突变猪模型，将为线粒体突变和疾病的研究提供有价值的替代工具。值得注意的是，人类POLG中关键的第274位氨基酸（D）在猪和小鼠中分别保守为第260位和第257位氨基酸。为实现猪POLG中的D260A点突变，需在猪基因组中引入一个精确的A-to-C碱基替换，这对常规碱基编辑器（胞嘧啶碱基编辑器：C-to-T或G-to-A；腺嘌呤碱基编辑器：A-to-G或T-to-C）而言具有挑战性。
Prime editing是一种近期开发的搜索-替换式基因组编辑技术，通过该技术可实现所有12种类型的碱基替换以及小片段插入和缺失，且无需双链断裂（DSBs）和外源供体DNA模板。在该系统中，prime editor version 2（PE2）由CRISPR-Cas9和工程化逆转录酶（RT）组成，其中RT与Cas9（H840A）切口酶融合，并由延伸的引导RNA [prime-editing guide RNA（pegRNA）]引导至靶位点。一旦Cas9（H840A）切口酶切开靶DNA，RT即根据pegRNA中存在的所需遗传信息进行整合。在PE3系统中，通过使用额外的切口单链引导RNA（nsgRNA）来切割未编辑链，使修复偏向编辑后的序列，从而进一步提高编辑效率。Prime editors（PEs）作为多功能且可编程的基因编辑工具，已成功应用于多种生物体的精确基因组编辑中，包括人类细胞、小鼠、兔和绵羊。然而，prime editing技术在猪中的应用仅限于体外培养的原代体细胞，且效率极低，而通过该技术构建猪模型的报道直到最近才出现。因此，利用prime editing系统执行猪POLG D260A（pPOLG D260A）突变以构建线粒体突变猪模型的可行性，仍需进一步探索。
在本研究中，基于对PE2和PE3系统在引入猪内源基因致病突变方面编辑效果的验证和优化，作者建立了携带pPOLG基因D260A点突变的猪胎儿成纤维细胞（PFF）系。利用这些PFF作为供核细胞进行体细胞核移植（SCNT），作者成功构建了携带纯合pPOLG D260A/D260A突变的线粒体突变猪模型，该模型表现出体细胞mtDNA突变的加速积累。值得注意的是，与中位寿命为48周的线粒体突变小鼠不同，大多数线粒体突变猪未能存活至7月龄，并表现出明显的早衰相关表型，包括体重下降、贫血、凋亡增加、衰老相关标志物表达增强，以及皮肤和睾丸间质的结构改变。因此，该线粒体突变猪模型可作为阐明mtDNA突变如何促成人类衰老及年龄相关疾病的优越平台。
